قلیایی پروتئاز

کاربرد و اصل

این پروتئاز قلیایی برای تعیین فعالیت پروتئاز ، بیان شده به عنوان واحد PC ، از آماده سازی مشتق شده از باسیلوس سوبتیلیس استفاده می شود. و Bacillus licheniformis var. این روش بر اساس 30 دقیقه هیدرولیز پروتئولیتیک کازئین در 37 درجه و pH 7.0 است. کازئین بدون هیدرولیز با فیلتراسیون برداشته می شود و کازئین محلول از نظر اسپکتروفتومتری تعیین می شود.

معرفها و محلولهای پروتئیناز قلیایی
کازئین از کازئین با درجه Hammarsten استفاده کنید (United States Biochemical Corp.، Catalog No. 12840، or معادل آن).
بافر Tris (pH 7.0) 12.1 گرم تریس (هیدروکسی متیل) آمینومتان با درجه آنزیم (یا معادل آن) را در 800 میلی لیتر آب حل کنید و با اسید کلریدریک 1 N به pH 7.0 تیتر کنید. به یک فلاسک 1000 میلی لیتری انتقال داده و با آب رقیق کرده و مخلوط کنید.
محلول TCA 18 گرم اسید تری کلرواستیک و 19 گرم استات سدیم تری هیدرات در 800 میلی لیتر آب در یک فلاسک حجمی 1000 میلی لیتری حل کرده و 20 میلی لیتر اسید استیک یخبندان اضافه کرده و با حجم آن رقیق شده و مخلوط می کنیم.
محلول سوبسترا 6.05 گرم تریس (هیدروکسی متیل) آمینومتان با درجه آنزیم را در 500 میلی لیتر آب حل کرده و 8 میلی لیتر اسید کلریدریک 1 نیتروژن اضافه کرده و مخلوط کنید. 7 گرم کازئین را در این محلول حل کرده و به مدت 30 دقیقه در یک حمام آب در حال جوش گرم کنید ، گاهی اوقات هم بزنید.
در دمای اتاق خنک شده و با pH 7.0 با اسید کلریدریک 0.2 N تنظیم کنید و اسید را با هم زدن شدید به آرامی اضافه کنید تا از رسوب کازئین جلوگیری کند. مخلوط را به یک فلاسک 1000 میلی لیتری منتقل کرده و با آب رقیق کرده و مخلوط کنید.

آماده سازی نمونه با استفاده از بافر Tris ، محلول آماده سازی آنزیم نمونه را تهیه کنید تا 2 میلی لیتر از رقت نهایی بین 10 تا 44 واحد پروتئاز باکتریایی داشته باشد.

روش پروتئیناز قلیایی
10.0 میلی لیتر از محلول بستر را درون هر یک از سری لوله های آزمایش 25 × 150 میلی متر پیپت کنید ، اجازه می دهید یک لوله برای هر آزمایش آنزیم ، یک لوله برای هر آنزیم خالی و یک لوله برای خالی بستر فراهم کنید. لوله ها را به مدت 15 دقیقه در یک حمام آب که در 37 ± ± 0.1 درجه نگهداری می شود ، تعادل دهید.
با شروع کرونومتر در زمان صفر ، به سرعت 2.0 میلی لیتر از آماده سازی نمونه را در بستر تعادل پیپت کنید. مخلوط کنید و لوله ها را در حمام آب جایگزین کنید. 2 میلی لیتر Tris Buffer (به جای آماده سازی نمونه) به خالی بستر اضافه کنید. دقیقاً بعد از 30 دقیقه ، 10 میلی لیتر محلول TCA به هر انکوباسیون آنزیم و به خالی بستر اضافه کنید تا واکنش متوقف شود. لوله ها را به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم کنید تا پروتئین کاملاً لخته شود.
در پایان دوره گرم شدن دوم ، هر لوله را به شدت تکان دهید و از طریق کاغذ فیلتر 11 سانتی متری Whatman No. 42 یا معادل آن فیلتر کنید و 3 میلی لیتر فیلتر اول را دور بریزید.
[توجه: فیلتر باید کاملاً شفاف باشد.]
میزان جذب هر نمونه فیلتراسیون را در یک سلول 1 سانتی متری ، در دمای 275 نانومتر ، با یک دستگاه اسپکتروفتومتر مناسب ، با استفاده از فیلتراسیون از خالی بستر تعیین کنید تا دستگاه صفر شود. با کم کردن مقدار خالی آنزیم مناسب ، هر قرائت را تصحیح کنید و مقدار بدست آمده را به صورت AU ثبت کنید.

منحنی استاندارد 100.0 میلی گرم L- تیروزین ، درجه كروماتوگرافی یا معادل آن (Aldrich Chemical Co.) را كه قبلاً به وزن ثابت خشك شده بود ، به یك فلاسك حجمی 1000 میلی لیتری منتقل كنید. در 60 میلی لیتر اسید کلریدریک 0.1 N حل کنید. وقتی کاملا حل شد ، محلول را با آب رقیق کنید و کاملاً مخلوط کنید. این محلول حاوی 100 میکروگرم تیروزین در 1.0 میلی لیتر است. سه رقت دیگر از این محلول موجود تهیه کنید تا حاوی 75.0 ، 50.0 و 25.0 میکروگرم تیروزین در میلی لیتر باشد. میزان جذب چهار محلول را در 275 نانومتر در یک سلول 1 سانتی متری در یک اسپکتروفتومتر مناسب در مقابل 0.006 N اسید کلریدریک تعیین کنید. یک قطعه جذب در مقابل غلظت تیروزین تهیه کنید.

محاسبه پروتئیناز قلیایی
یک واحد پروتئاز باکتریایی (PC) به عنوان آنزیمی تعریف می شود که در شرایط آزمایش معادل 1.5 میکروگرم در میلی لیتر L-تیروزین در دقیقه تولید می کند.
از منحنی استاندارد و با استفاده از درون یابی ، میزان جذب محلول با غلظت تیروزین 60 میکروگرم در میلی لیتر را تعیین کنید. باید رقمی نزدیک به 0.0115 بدست آورد. مقدار درون یابی را بر 40 تقسیم کنید تا جذب معادل محلول دارای غلظت تیروزین 1.5 میکروگرم در میلی لیتر بدست آید و مقدار بدست آمده را به عنوان AS ثبت کنید.
فعالیت آماده سازی آنزیم نمونه را با معادله محاسبه کنید

PC / g = (AU / AS) × (22 / 30W)

که در آن 22 حجم نهایی مخلوط واکنش در میلی لیتر است. 30 در دقیقه زمان واکنش است. و W وزن نمونه اصلی گرفته شده در گرم است.

بسته بندی و ذخیره سازی پروتئیناز قلیایی

کیسه بسته بندی مواد غذایی جامد ، 25 کیلوگرم در بشکه.

قلیایی پروتئاز باید در مکانهای خشک ، خنک و دارای تهویه مناسب و دور از آفتاب ، گرما نگهداری شود.

پرداخت :T / T ، Paypal ، Western Union ، Alibaba Trade Assurance ، VISA ، MasterCard ، بررسی الکترونیکی ، پرداخت بعدا ، LC و غیره